***、配制前的準備

　　1. 配方確認與計算

　　- 根據實(shí)驗目的選擇培養基類(lèi)型(如營(yíng)養瓊脂、LB液體、沙保弱培養基等)，嚴格按照標準配方稱(chēng)量成分。

　　- 注意特殊成分的處理：如酵母提取物、蛋白胨需充分溶解；痕量元素(如Mg2?、Ca2?)應預先溶解后添加。

　　- 計算水量時(shí)需扣除其他液體成分(如葡萄糖溶液、維生素溶液)的體積。

　　2. 容器與工具準備

　　- 使用玻璃或耐腐蝕塑料容器(如錐形瓶、培養皿)，避免金屬器具直接接觸培養基。

　　- 器皿需提前清洗并烘干，防止水分殘留導致滲透壓變化。

　　- 磁力攪拌器、pH計、電子天平等設備需校準，確保測量精度。

　　二、配制與滅菌

　　1. 溶解與混合

　　- 按配方順序依次加入成分，先加水后加耐熱物質(zhì)(如瓊脂)，***后添加熱敏感物質(zhì)(如抗生素、血清)。

　　- 加熱時(shí)持續攪拌，避免局部過(guò)熱導致焦糊或成分分解。

　　- 瓊脂融化后需煮沸1-2分鐘，確保膠體均勻分布。

　　2. pH調節

　　- 冷卻至50-60℃時(shí)調節pH，使用精密pH計(誤差≤0.01)逐滴加入1mol/L NaOH或HCl。

　　- 避免過(guò)度調節：每滴酸堿可影響pH約0.2-0.3，需緩慢調整至目標范圍(如大腸桿菌培養基pH 7.0±0.2)。

　　- 高溫下pH會(huì )因蒸發(fā)而升高，需預留0.1-0.2的補償值。

　　3. 滅菌操作

　　- 高壓蒸汽滅菌：液體培養基121℃、15分鐘；含糖培養基需115℃、20分鐘以防焦糖化。

　　- 過(guò)濾除菌：適用于熱敏感成分(如胎牛血清)，采用0.22μm濾膜正壓過(guò)濾。

　　- 滅菌后立即搖勻并冷卻，避免沉淀凝結或污染。

　　三、分裝與儲存

　　1. 分裝規范

　　- 固體培養基倒入培養皿時(shí)需均勻鋪展，厚度約3-5mm，避免氣泡產(chǎn)生。

　　- 液體培養基按實(shí)驗需求分裝(如試管裝量不超過(guò)1/5體積，搖瓶裝量為1/10)。

　　- 斜面培養基傾注后需靜置凝固，形成平整斜面。

　　2. 儲存條件

　　- 已滅菌培養基需在2周內使用，4℃冷藏時(shí)密封避光，防止水分蒸發(fā)或污染。

　　- 含淀粉類(lèi)成分的培養基易老化，需現配現用。

　　- 添加劑(如抗生素、指示劑)宜單獨儲存，使用時(shí)按需加入。

　　四、接種與培養

　　1. 無(wú)菌操作

　　- 接種前用75%酒精擦拭工作臺面，點(diǎn)燃酒精燈形成無(wú)菌區。

　　- 接種環(huán)需灼燒滅菌，待冷卻后挑取菌種，避免高溫殺死目標菌。

　　- 劃線(xiàn)法接種時(shí)注意分區分離，第三區后不再返回前區，防止交叉污染。

　　2. 培養條件控制

　　- 溫度：嚴格按菌種需求設定(如大腸桿菌37℃、乳酸菌30℃、嗜熱菌55℃)。

　　- 氣體環(huán)境：厭氧菌需抽真空充氮或使用厭氧罐；CO?依賴(lài)菌需5%-10% CO?環(huán)境。

　　- 濕度與避光：培養箱內放置水盤(pán)維持濕度，光敏感菌種需用黑袋包裹。

　　五、常見(jiàn)問(wèn)題與應對

　　1. 污染控制

　　- 霉菌污染：多因滅菌不干凈或操作時(shí)間過(guò)長(cháng)，需延長(cháng)滅菌時(shí)間或縮短接種流程。

　　- 細菌污染：可能來(lái)自吸管、槍頭或空氣，需更換無(wú)菌耗材并加強超凈臺維護。

　　- 支原體污染：定期檢測細胞系，使用含青霉素、支原體清除劑的培養基。

　　2. 培養基異常

　　- 不凝固：瓊脂濃度不足或pH過(guò)高，需補加瓊脂并重新滅菌。

　　- 顏色變化：指示劑失效或成分氧化，應檢查原料有效期并避光保存。

　　- 菌落形態(tài)異常：滲透壓偏差或缺乏生長(cháng)因子，需復核配方并補充酵母提取物等。

　　六、特殊培養基的使用要點(diǎn)

　　1. 選擇性培養基(如麥康凱瓊脂)：

　　- 膽鹽、結晶紫需溶解，抑菌劑濃度需精確控制。

　　- 目標菌(如大腸桿菌)應形成典型菌落，抑制雜菌生長(cháng)。

　　2. 鑒別培養基(如伊紅美藍瓊脂)：

　　- 顯色反應需在規定時(shí)間內觀(guān)察，避免過(guò)度曝光導致顏色掩蓋。

　　3. 富集培養基(如GN增菌液)：

　　- 專(zhuān)性菌種優(yōu)先增殖，需配合選擇性平板進(jìn)行二次分離。

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