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由CompuCyte開(kāi)發(fā)的新的細胞分析儀-激光掃描細胞儀(Laser Scanning Cytometer, LSC)，以多組參數分析細胞及形態(tài)，是當今世界上***先進(jìn)的細胞生物學(xué)分析儀器,在細胞生物學(xué)、免疫學(xué)、病理學(xué)、藥理學(xué)、遺傳學(xué)、腫瘤學(xué)等領(lǐng)域已成為新***代強有力的研究工具,受到了生物醫學(xué)界的極大關(guān)注, 已成為***內外的***個(gè)注目點(diǎn)。 

定量細胞內物質(zhì)及組織掃描

多時(shí)段同點(diǎn)分析

適應多種樣本類(lèi)型，包括：

組織

 粘附細胞

具有完整的顯微鏡功能 

流式細胞儀已在全世界廣泛應用。然而，仍有許多任務(wù)流式細胞無(wú)法完成，比如檢測細胞粘附、相隔時(shí)間重復檢測同***細胞和在細胞上或胞內定位探針染色位置。流式細胞儀很難檢測只含有數百個(gè)細胞的樣本，而此問(wèn)題在檢測只含有數百個(gè)細胞的多達1536個(gè)微孔時(shí)更加復雜了。***些儀器如共聚焦顯微鏡和微板掃描圖像系統可作高分辨分析及提供其他分析功能，但只能提供低通量分析并要求操作者經(jīng)驗豐富。激光掃描細胞儀,它可以進(jìn)行低分辨分析，像流式細胞儀***樣對散射光和熒光進(jìn)行多參數檢測，從而提供高通量的分析。 

LSC應用：

關(guān)鍵應用示例

任何基于細胞學(xué)的研究

任何組織切片的研究 

細胞周期和DNA含量分析: 抗原表達, 免疫分型 

多元化分析：

凋亡

遷移

細胞活性

膜電位 

細胞周期信息由生物化學(xué)及形態(tài)學(xué)信息構成。

細胞周期可通過(guò)直接檢測DNA的含量來(lái)獲知。 

對生物學(xué)樣本的多色分析: 因LSC具備了高通量的能力，在生物學(xué)單細胞分析領(lǐng)域和細胞分析學(xué)中已變得越來(lái)越重要。結合不同的技術(shù)與染色方法，可對任何***個(gè)單細胞的多色分析。對于細胞分析來(lái)說(shuō)，玻片式細胞儀（SBC）是實(shí)現這種技術(shù)的理想工作，它不像流式細胞儀，它沒(méi)有任何損耗，如樣本是被固定的載玻片上的并能夠重復進(jìn)行染色并檢測。方法和結果：我們在激光掃描細胞儀上（Laser Scanning Cytometer）進(jìn)行了多種多色熒光分析實(shí)驗。其中包括了不同的實(shí)驗過(guò)程，（1）多色細胞分相反，對***份樣本使用八種或更多熒光素進(jìn)行染色；（2）重復染色，使用同***熒光標記的不同抗體進(jìn)行染色后逐***分析；（3）熒光淬滅，根據熒光的不同淬滅特征進(jìn)行不同的淬滅實(shí)驗；（4）熒光激活，激活不同的熒光顆?；蛉玖?；（5）光化裂解（裂解FRET染料）。通過(guò)LSC的重定位功能，可以以1um的精度對樣本中的同***細胞重復定位，從而經(jīng)過(guò)不同處理的樣本可再次進(jìn)行分析。結論：給合各種方法與技術(shù)，可在單細胞水平上進(jìn)行多色熒光分析。 

同時(shí)分析多個(gè)樣本中細胞對于培養物的反應在生物實(shí)驗及化療效果評估中有重要作用。在此我們使用LSC來(lái)對多孔藥物誘導凋亡進(jìn)行分析檢測。材料：使用2-MNOH或其他常用的化學(xué)藥物來(lái)誘導細胞凋亡。我們分析了96孔中經(jīng)熒光標記的細胞凋亡情況。結果：我們證實(shí)LSC是***種在單細胞水平同時(shí)比較分析不同孔內細胞在不同時(shí)間及藥物濃度情況下的變化。結論：這些數據有力說(shuō)明了LSC適合于在單細胞水平同時(shí)、多參數分析不同細胞群體對藥物的反應。

LSC，尺寸大約與研究級臺式流式細胞儀相同大小，是當前制作最為精細的激光掃描細胞儀，可檢測由標準488nm氬離子激光器激發(fā)的綠色(530-nm), 橙色 (580-nm),和紅色 (610-nm) 熒光；由488nm或633nm氦氖激光器激發(fā)的遠紅(670-nm) 和近紫外 (750-nm)熒光。藍色熒光素(460nm)可由400nm紫羅蘭半導體激光器激發(fā)，綠色氦氖激光器(543-nm)也可選配。

LSC儀器檢測為高分辨放大模式，一個(gè)典型的細胞圖像包含有上百個(gè)像素。

在LSC上，激光聚焦光束（通常為空冷488nm氬離子激光或633nm氦氖激光）通過(guò)檢流計驅動(dòng)的一組透鏡來(lái)獲得光束的直徑，然后經(jīng)過(guò)顯微鏡的長(cháng)通濾片，從而在標本上形成2.5至10nm直徑的光束。

檢流計是由一個(gè)“鋸齒”信號來(lái)控制，它的振幅隨時(shí)間呈線(xiàn)性增長(cháng)隨后又快速恢復初始值。當在線(xiàn)性信號部分時(shí)，激光聚焦光束在標本平面上呈線(xiàn)性移動(dòng)。此線(xiàn)性移動(dòng)的長(cháng)度在171和685um之間，由物鏡的放大率決定。激光束方向的熒光信號由顯微鏡的物鏡收集，隨后通過(guò)二向色濾片，然后經(jīng)過(guò)不同帶寬的濾光片分離進(jìn)入其各的光電倍增管。光電倍增管信號以規律性的間距數字化，從而形成一組數據與0.5um掃描間距相一致的像素。在每一掃描線(xiàn)末端，顯微鏡的載物平臺與掃描垂直的方向移動(dòng)0.5um，然后整個(gè)過(guò)程重復進(jìn)行。如此，儀器便可生成矩形掃描區域內一個(gè)或多個(gè)熒光的數字影像。LSC還集成了一個(gè)前向散射光信號，使用顯微鏡鏡臺下冷凝器來(lái)收集光信號，然后由一個(gè)光敏二極管來(lái)檢測光散射信號，與流式細胞儀類(lèi)似，前向方向也有一擋且擋穿透的激光。大角度散射光在實(shí)驗機上可檢測，但在現有的商品機中還不可用。

在流式細胞儀中，探測器或前置放大器輸出的是***組脈沖信號，細胞在隨意的時(shí)間里經(jīng)過(guò)檢測點(diǎn)形成了信號之間隨意間隔；細胞的光散射信號和熒光信號可由脈沖信號的高度和面積或寬度來(lái)表示。在大多數儀器中，收集的信號被轉化并存儲為脈沖信號，擁有高度、面積和寬度值，然后由電子計算機轉化這些信號作進(jìn)***步分析。信號隨著(zhù)不規則的間隔（由細胞檢測的隨機時(shí)間決定）而被數字化并記錄下來(lái)。
在激光掃描細胞儀中，探測器或前置放大器所輸出的信號是***個(gè)對樣本***定區域的光柵掃描信號，并以衡定的間隔被數字化，所產(chǎn)生的是數字矩陣信號，其中包括了***幅圖片的***個(gè)原素或像素。有關(guān)***個(gè)細胞的數據以***個(gè)數量***的連續像素來(lái)表示；這個(gè)數量***在低分辨系統時(shí)可能是10，而在高分辨系統中會(huì )達到100。然而，盡管激光掃描細胞儀的圖像有效像素會(huì )小至與高分辨數字顯微鏡***樣（0.5um），但它的空間分辨率會(huì )低些，因為激光的聚焦光束大于***個(gè)像素的空間。

激光光束特性

激光作為細胞儀的光源是因為它所輸出的激光能被聚焦成為很小斑點(diǎn)。然而，根據激光基礎物理學(xué)，聚焦光斑越小，在光束聚焦后的光路上發(fā)生的散射越快。這個(gè)現象在共聚焦顯微鏡和多光子顯微鏡中都會(huì )發(fā)生，而它們典型的光斑< 1um，聚焦深度不到***個(gè)微米，并且聚焦光斑在每個(gè)檢測點(diǎn)上會(huì )快速上下移動(dòng)。這樣便可在薄的標本切片上獲得高分辨率熒光圖像或三維結構圖。典型的流式細胞儀聚集光斑的尺寸50-120um寬—形成***個(gè)比樣本流寬的穩定的光束；光斑的高度為5-50nm；更窄的聚焦光束可得到更為詳細的有關(guān)細胞尺寸的信息，但因光線(xiàn)的發(fā)散，會(huì )使在極小角度收集散射光的步驟復雜化。激光光斑寬度和高度的臨界尺寸在幾百微米左右。當光束高度比細胞小時(shí)，流式細胞儀的空間分辨率好；當光束增大趕到比細胞大幾倍時(shí)，分辨率降低直至無(wú)信號出現。

在激光掃描細胞儀中，聚焦光斑，或腰部（***細處，典型的為2.5-10um）界于流式細胞儀和共焦之間。聚焦的深度為100um，可在載玻片或毛細管中形成并收集統***的信號。盡管圖像的像素之間有間隔（0.5-4um），但視覺(jué)的分辨率卻不高，因為聚焦光斑（2.5-10um）比像素本身要大。